CRlSPR/Cas9通过gRNA指导Cas9核酸酶对靶标基因进行 DNA修饰，以此造成基因的功能突变或缺失。利用 CRlSPR/Cas9 技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，gRNA文库的建立将在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。



sgRNA文库包括敲除任一人类或小鼠基因的特异性sgRNA序列。每个种属特异性文库分为两个子文库（A和B）。当A和B一起使用，每个基因含有6条sgRNAs（每个文库含有3条）。我们推荐尽可能使用完整库筛选，但是如果无法获得完整库的情况下，也可以使用子库进行筛选。由于文库里构建的sgRNA数量增加，筛选过程中需要的细胞量也会更多，因此这种筛选的设计具有灵活性，可以更小规模的A文库（每个基因3条sgRNAs）或者用整个文库（每个基因6条sgRNAs）进行筛选。



常用单载体文库骨架示意图：



CRlSPR/Cas9 gRNA 文库筛选流程:

CRlSPR/Cas9 gRNA 文库筛选大体流程分为五步，即 gRNA 文库选择、gRNA 文库扩增、gRNA 文库慢病毒包装、gRNA 文库筛选、PCR 扩增和 NGS 测序。



1、  gRNA 文库选择

首先选择所需 gRNA 文库。包括全基因组库和定制文库，采用单/双慢病毒载体，这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。

2、gRNA 文库扩增

gRNA 载体构建完成后混合成一个 pool（即载体混合库），随后将载体混合库进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。

3、gRNA 文库慢病毒包装

扩增后的 gRNA 文库进行慢病毒的包装，获得混合型慢病毒库，每个慢病毒载体携带单个 gRNA。

4、gRNA 文库筛选

对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验。慢病毒库以较低的 MOI 值感染细胞（确保每个细胞最多进入一个慢病毒），随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理，最后经过不同的筛选方式富集细胞。

5、PCR 扩增和 NGS 测序

对富集下来的细胞进行PCR 扩增，该扩增片段包含载体所携带的 gRNA 序列，通过后续的 NGS 测序，我们可以得到富集细胞中 gRNA 的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。



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