稳定细胞株构建


外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天；一类是稳定表达（构建稳转株），外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。

建立稳定细胞株，基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，筛选得到可稳定表达目的蛋白、或稳定沉默特定基因的细胞株。



筛选方法

慢病毒感染筛选稳定细胞株

利用慢病毒整合表达特性来筛选稳定细胞株，该方法克服了传统质粒挑单克隆方法周期久的弊端，可以在短时间内高效获取稳定细胞株。



利用慢病毒制备稳定株优势

（1）细胞适用种类广泛，可用于各种哺乳动物细胞；

（2）构建稳转株时间短，表达持续时间长；

（3）多种荧光标记和抗性基因可选，满足观测实验要求。




稳定细胞株分类

混合克隆稳定细胞株

混合克隆细胞系是基因转染后直接用抗药筛选得到的，筛选出的细胞都表达抗性基因和目的基因，但包含了各种不同的细胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表达量均有所不同。

混合克隆细胞株筛选比较快速，费用较低。在需要构建的细胞株转染效率高，目的基因表达效率高的情况下，单克隆细胞株最后得到的表达效果和混合克隆细胞株并没有显著差异，这时多克隆细胞筛选是理想的选择。

单克隆稳定细胞株

单克隆细胞系是由含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增得到的细胞株，每个细胞的目的基因整合位置的表达量均高度一致，但可能丢失一些表型。单克隆细胞株筛选周期长，费用高。需要进行细胞亚定位实验的细胞系，难感染的和表达率低的通常建议进行单克隆细胞筛选。