AAV股票代码
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腺相关病毒股票代码
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腺相关病毒AAV

腺相关病毒AAV

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腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvoviridae)家族的成员之一,是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒,其直径约20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus, rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体,由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等,rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

AAV基因组结构

 

 rAAV包装纯化及滴度检测
      AAV包装过程中,包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列(ITR,对于病毒的复制和包装具有决定性作用),辅助质粒包含AAV包装所需的cap(编码病毒衣壳蛋白)和rep(参与病毒的复制)基因,以及腺病毒Helper质粒。三种质粒共同转染293T细胞后,AAV病毒开始复制和包装。新普京888.3app腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。另外,我们也可以根据使用者要求,提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013 VG/ml,完全可以满足各类整体实验的使用要求。
AAV包装流程图

滴度检测方法:定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。
滴度检测原理:腺相关病毒的基因组为单链DNA,外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

 rAAV侵染细胞过程
    纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞,侵染细胞时,AAV与细胞表面特异性受体结合,激活胞内信号通路,进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞,在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核,随后病毒裂解,其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。

rAAV作用机制

 rAAV载体优势
1、安全性高、免疫原性低:AAV是一种复制缺陷型DNA病毒,无自主复制能力,野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合,rAAV不整合。目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道,也是FDA批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。
2、宿主细胞范围广:AAV具有广泛的宿主范围,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
3、扩散能力强:AAV直径约20-26nm,体积小,滴度高,具有良好的扩散能力,其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血脑屏障的能力,在神经科学领域应用广泛。
4、体内表达基因时间长:AAV具有保持长期基因转录表达能力,体内表达一般3周可以达到高峰,随后持续高表达,作用时间>5个月。
5、种类多样:AAV血清型众多,此外,根据不同的实验设计,我们还在不断的突变,筛选新的血清型(AAV1-13,AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…)。

不同病毒的生物学特性比较
    基于上述特点,AAV被视为是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中,与其他常用病毒工具载体相比,AAV具有感染过程温和长效的表达能力,是基因操作的利器。

 rAAV血清型选择
      目前已注册的AAV种类总数已超过196种,灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV(即AAV1-AAV13),其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身,值得注意的是,AAV2是最早被克隆的病毒,也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入,研究人员发现不同血清型的AAV之间可以杂交,而杂交后的AAV会兼有杂合双方的特点,因此,AAV亚型顺势诞生。
     现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性(不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性),表现出一定的器官靶向特异性。
不同血清型AAV的组织嗜亲性
血清型 组织亲和性
rAAV2/1 神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌
rAAV2/2 视网膜、神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌
rAAV2/3 肌肉,肝脏,肺,眼
rAAV2/4 神经系统,肌肉,眼,脑
rAAV2/5 神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节
rAAV2/6 神经系统,肺,肌肉,心脏
rAAV2/7 肌肉,肝脏
rAAV2/8 神经系统,肝脏,肌肉,脂肪组织,胰腺,视网膜,
rAAV2/9 神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤
rAAV2-retro 神经系统(逆向非跨突触)
AAV-PHP.eB 跨血脑屏障(静脉注射)
AAV-PHP.S 全外周神经(尾静脉注射)
AAV-PAN 胰腺(腹腔注射)
AAV-LUNG 肺(尾静脉注射)
AAV-DJ 视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞
AAV-7m8 视网膜
AAV-ShH10Y 视网膜Muller细胞
AAV-Rh10 肝脏,血液,心脏,体外感染细胞
AAV-Anc80L65 内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9 SVZ区神经干细胞

      小建议:如您不确定选择哪种血清型,可尝试使用新普京888.3appPandora’s Virus (AAV多种血清型)进行预实验,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,摸索最佳实验条件(注射方法、注射位点、病毒用量等),以便得到更理想的实验结果。
      Pandora’s Virus 详情:

 

 rAAV载体应用案例
1、在神经科学领域中的应用
1.1 外侧缰核&光遗传学
客户发表文章:Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]
 

注射部位:小鼠LHb
载体:AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型:AAV2/9
病毒滴度:6.29E+12 VG/mL
注射体积:100nl
观察时间:1个月

1.2 臂旁核&化学遗传学
客户发表文章:Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]

注射部位:小鼠PBN
载体:AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型:AAV2/9
病毒滴度:1E+13 VG/mL
注射体积:150nl
观察时间:3周

1.3 丘脑&钙离子成像
客户发表文章:客户发表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]

注射部位:小鼠PVT
载体:AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射体积:100nl
观察时间:4周

1.4 丘脑室旁核&杀死神经元
客户发表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]

注射部位:小鼠PVT
载体:AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射体积:两支病毒1:1混合注射100nl
观察时间:4周

1.5 海马、皮层&逆向非跨突触(rAAV2/retro)
客户发表文章:Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相关病毒, 焦虑症, 光遗传]


注射部位:小鼠dmPFC、VHPC
载体:AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射体积:300nl
观察时间:4周

1.6 初级运动皮层&顺向跨突触(rAAV2/1)
Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]

注射部位:小鼠皮层M1、PMC
载体:rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度:rAAV2/1: 5E+12 VG/mL;rAAV2/9-DIO-hChR2:1.2E+13 VG/mL;rAAV2/9-DIO-GCaMP6s:1E+12 VG/mL
注射体积:多点注射,每位点30-40nl
观察时间:4周

1.7 边缘前皮质&跨突触示踪(WGA-Cre)
客户发表文章:Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]

注射部位:小鼠PrL
载体:AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度:4.28E+12 VG/mL
注射体积:300nl
观察时间:4周

1.8 皮层&AAV干扰(AAV-shRNA)
客户发表文章:Nature Medicine. (IF=22.864). Cao X,et.al. (2013). Astrocyte-derived ATP modulates depressive-like behaviors.[腺相关病毒, 抑郁症]


注射部位:小鼠mPFC
载体:AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
病毒滴度:3E+12 VG/mL
注射体积:1.5ul
观察时间:2周

1.9 全脑表达&跨血脑屏障(AAV-PHP.eB)
 

 
新普京888.3app—rAAV-PHP.eB尾静脉注射感染全脑实例
病毒总量:1.5E+11VG
注射体积:200ul
病毒表达时间:四周

1.10稀疏标记
应用文献:Luo WS, et al., (2016) Supernova: A Versatile Vector System for Single Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci Rep.
载体信息:pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre(108-109VG/mL)、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE(1012VG/mL)

1.11在视网膜中的应用

新普京888.3app—玻璃体腔注射
病毒载体:AAV-syn-GcaMP6s

2、在其他脏器中的应用
2.1 rAAV感染肝脏

 
新普京888.3app—rAAV2/8尾静脉注射感染肝脏实例
病毒总量:1E+11VG
注射体积:200ul
病毒表达时间:四周

2.2 rAAV感染心脏

 
新普京888.3app—rAAV2/9尾静脉注射感染心脏实例
病毒总量:2E+11VG
注射体积:200ul
病毒表达时间:四周

2.3 rAAV感染肺部

 
新普京888.3app—rAAV-Lung尾静脉注射感染肺部实例
病毒总量:5E+11VG
注射体积:200ul
病毒表达时间:二周

客户发表文章:Cell. (IF=36.216). Huijuan Wu,et.al. (2020). Progressive Pulmonary Fibrosis Is Caused by Elevated Mechanical Tension on Alveolar Stem Cells. [腺相关病毒, 干扰]


注射方式:气管注射
感染部位:肺部
载体:pAAV-Tgfb1 shRNA
血清型:rAAV2/9
病毒注射量:1E+11 VG(50ul)
观察时间:3周
 

2.4 rAAV感染肾脏

 
新普京888.3app—rAAV2/8尾静脉注射感染肾脏实例
病毒总量:2E+11VG
注射体积:200ul
病毒表达时间:四周

2.5 rAAV感染脂肪组织

新普京888.3app—rAAV2/8腹股沟脂肪多点注射感染脂肪实例
病毒总量:4E+10VG/侧
病毒表达时间:四周

2.6 rAAV感染肌肉组织

新普京888.3app—rAAV2/8后腿肌肉多点注射感染肌肉实例
病毒总量:4E+10/侧
病毒表达时间:四周

2.7 rAAV感染胰腺
新普京888.3app—rAAV-PAN腹腔注射胰腺实例
病毒总量:4E+11VG
表达检测时间:4周

 


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