基因过表达

　　基因功能研究中通常需要上调目的基因的表达来观察表型的变化。过表达是将目的基因在宿主细胞大量表达的过程，其基本原理是将目的基因构建到工具载体上，导入细胞使基因实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。工具载体通常包括原核表达载体、普通真核表达载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。

工具载体介绍

根据实验需要不同，目的基因大小等选择不同的载体，包括真核表达载体和病毒载体等均可以实现编码基因和非编码基因的过表达。

表达系统	真核表达载体	慢病毒载体	重组腺相关病毒载体	重组腺病毒载体
载体基因特性	双链DNA质粒	RNA逆转录病毒	单链DNA病毒	双链DNA病毒
外源基因表达时间	24h开始表达，持续3-7天	2-4天开始表达，长时间稳定表达	7-14天开始表达	1-2天开始表达
插入片段大小	8kb左右	4kb左右	2.8kb左右	6kb左右
稳定细胞株筛选	难操作	可以	不可以	不可以，瞬时表达
细胞实验	细胞系，部分转染效率低	首选，广谱，感染效率高	不适合	广谱，感染效率高
动物实验	不适合	适合，根据观察时间和注射部位	首选，根据观察时间和注射部位	免疫原性高，慎选
滴度范围	无	10⁸~10⁹TU/ml	10¹²-10¹³vg/ml	10¹⁰-10¹¹pfu/ml

载体图谱中常见元件介绍

元件名称	类型	用途
启动子	CMV、CAG、EF1a、U6等	广谱或特异启动目的基因的表达
启动子	hSyn、CaMKIIα等	特异性启动子，在特定的组织细胞中启动目的基因的表达
蛋白标签	3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等	与目的基因融合表达，常用于检测外源蛋白表达水平
荧光标记	EGFP、mCherry、mNeonGreen等	可与目的基因融合或非融合表达用于检测转染、感染效果
抗性基因	Puro、Neo、Hygro、BSD等	真核抗性，常用于稳定株筛选
抗性基因	Amp、Kan	原核抗性，常用于原核细菌培养，质粒扩增
连接元件	Linker	用于连接两个基因，融合表达时常用，可降低因融合表达对蛋白折叠和功能的影响
连接元件	IRES、2A	用于连接两个基因，达到非融合表达的效果
其它元件	WPRE	增加目的基因的表达

载体选择（部分）

病毒载体的选择，根据实验的需求参考慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒等。

载体类别	编号	载体元件
慢病毒过表达	GL127	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE
	GL121	pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE
	GL107	pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE
	GL122	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE
	GL124	pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE
腺病毒过表达	H225	pADV-mCMV-MCS-3xFLAG
	H201	pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG
	H213	pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP
	H204	pADV-mCMV-mCherry-HA
腺相关病毒过表达	AOV024	pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV025	pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV064	pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE
	AOV065	AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE
	H9429	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H9525	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10881	pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA
	H10886	pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA

服务简介

根据客户提供的基因信息，从生物信息学网站上调出该基因的cDNA序列，将cDNA序列构建到工具载体中，根据实验需求过表达编码基因或者非编码基因。针对病毒载体，包装生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。

病毒载体服务流程

物种及目的基因名称
病毒载体要求与选择
其它特殊需求
病毒表达载体构建
病毒包装与纯化）
滴度测定
高滴度的病毒颗粒
按合同提供对照病毒）
实验报告

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