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疾病研究(心、肝、肺)

疾病研究(心、肝、肺)

  基于对病毒载体的深入了解和研发,越来越多的科研人员开始借助病毒载体进行疾病研究。目前,病毒载体工具在不同组织器官中均有大量的应用,通过使用工具病毒载体,对疾病相关基因进行定向和组织特异性的改造和操控,已成为科研人员进行疾病研究与治疗的一种技术手段。

  病毒载体的选择
  
  不同病毒载体的大小迥异,意味着其内含基因容量存在巨大差异;免疫原性的不同,意味着其体内/体外应用的场景需要细微调整;表达时间和周期的不同,意味着我们需要根据研究需求进行相对应的选择。

表1 不同病毒的生物学特性比较
  慢病毒 腺相关病毒 腺病毒 逆转录病毒
包膜
颗粒直径 80-100 nm 20-30 nm 90-100nm ~100nm
基因组 dsRNA ssDNA dsDNA RNA
基因组大小 9.75kb 4.7kb 36kb ~5kb
表达起始时间 48-72h 72-96h 24-48h 48-72h
表达持续时间 > 2 months > 6 months < 1 month > 2 months
体内扩散能力 一般 一般
免疫原性 中等 极低 中等
滴度范围 108~109TU/mL 1012-1013VG/mL 1011-1012PFU/mL 107~108TU/mL
滴度检测方法 qPCR整合DNA qPCR非整合DNA 抗原抗体免疫染色试剂盒 qPCR整合DNA
整合方式 随机高频整合 定向低频整合(rAAV不整合) 非整合 随机整合
应用范围 体外细胞感染,gRNA文库筛选,体内 基于不同的血清型,体内广泛应用 嗜肝,快速表达或短期表达,血液、心脏,细胞系等  特异性只感染分裂期的细胞
  重组腺相关病毒载体(rAAV),一直是体内研究的明星载体,除了其免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势外,还在于其种类多样性。
  
  现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性,表现出一定的器官靶向特异性。
表2 不同血清型AAV的组织嗜亲性
血清型 组织亲和性
rAAV2/1 神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌
rAAV2/2 神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌,眼
rAAV2/3 肌肉,肝脏,肺,眼
rAAV2/4 神经系统,肌肉,眼,脑
rAAV2/5 神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节
rAAV2/6 神经系统,肺,肌肉,心脏
rAAV2/7 肌肉,肝脏
rAAV2/8 神经系统,肝脏,胰腺,视网膜,脂肪组织
rAAV2/9 神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤,肌肉,脂肪组织
rAAV2-retro 神经系统(逆向非跨突触)
AAV-PHP.eB 跨血脑屏障(静脉注射)
AAV-PHP.S 全外周神经(尾静脉注射)
AAV-PAN 胰腺(腹腔注射)
AAV-LUNG 肺(尾静脉注射)
AAV-DJ 视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞
AAV-7m8 视网膜
AAV-ShH10Y 视网膜Muller细胞
AAV-Rh10 肝脏,血液,心脏,体外感染细胞
AAV-Anc80L65 内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9 SVZ区神经干细胞
 
  小建议:如您不确定选择哪种血清型,可尝试使用新普京888.3appPandora’s Virus (AAV试用装)进行预实验,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,摸索最佳实验条件(注射方法、注射位点、病毒用量等),以便得到更理想的实验结果。(链接到Pandora’s Virus>>)

肝脏

  肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的重要器官,其功能异常会导致脂肪肝、高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病等疾病。
  
  1、注射方式
  
  应用病毒载体感染肝脏一般采用尾静脉注射的方式。
  
  按照新普京888.3app多年的经验,使用AAV载体感染肝脏组织一般选取AAV2/8血清型,通过尾静脉注射手段感染肝脏每只小鼠需要注射1x1010总滴度的病毒载体。
 
  
  新普京888.3appAAV感染结果
  
  2、应用案例
  
  2.1 肝脏特异启动子TGB
  
  客户发表文章:FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝,自噬溶酶体,腺相关病毒过表达]
`
  
  注射方式:小鼠尾静脉注射
  
  载体:AAV8-TGB-Fabp1
  
  血清型:rAAV2/8
  
  注射量:200ul,2× 1011 VG
  
  观察时间:1周
  
  2.2 Cre-loxp技术在小鼠肝脏中的应用
  
  由于腺病毒高度嗜肝,几乎90%以上会感染肝脏,因此腺病毒可以作为肝脏特异性感染的有效载体。将Cre腺病毒(Ad-Cre)通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内,即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除,从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。
  
  2.3 CRISPR/Cas9技术在小鼠肝脏中的应用
  
  通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件(Cas9和sgRNA)注射入小鼠体内,可以实现在肝脏中特异性表达,并实现肝脏部位的特异性敲除。此方法比较适合检验活体实验。

胰腺

  胰腺是一个兼有内、外分泌功能的器官,与机体消化、血糖代谢、脂质代谢等有密切的关系,也是代谢研究的关键目标器官之一。
  
  在实际研究中,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,一种是使用AAV2/8病毒载体,通过胆管将病毒注射入胰腺;另一种新方法是使用新普京888.3app新研发的AAV-PAN病毒载体,腹腔注射感染胰腺:
新普京888.3appAAV-PAN感染结果

心脏

  1、注射方式
  
  AAV的注射方式,不同的文章中采用了不一样的注射方式。总体上,一般包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。
  
  尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环,分布较均匀。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul,效果是在注射的局部点附近表达较高,但扩散非常有限。总的来说,很多实验直接用尾静脉注射即可,但是可能需要较高剂量的病毒,如果用心肌内定点注射,即小量多点注射,可以达到很好的感染表达效果,但是后者操作技术难度略高,也需要花费更长的操作时间。
  
  结合新生鼠(出生2-10天)注射效果比较来看,新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠,消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射,一般根据实验室的条件来看,可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内(左心室)注射,目的是将病毒导入血液循环中。
  
  2、启动子选择
  
  一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。很多高效的启动子由于片段较大,如αMHC,仅用于转基因小鼠等实验,不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献,我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强,特别对于大片段的驱动效果很明显,但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达,则推荐使用cTnT启动子,cTnT常被用于心肌的特异性表达,表达能力也很强。
  
  3、应用案例
  
  3.1 心脏特异性启动子cTNT
  
  客户发表文章:Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.
  
  注射方式:
  
  载体:AAV9
  
  血清型:rAAV2/9
  
  启动子:cTnT
  
  注射量:200ul,2× 1011 VG
  
  观察时间:1周
  
  3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠
  
  科学家构建了带有eSpCas9(1.1)的心脏特异性转基因小鼠,通过Myh6基因的启动子(αMHC)驱动Cas9在心肌的特异性表达。αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达,而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。
  
  Cas9转基因小鼠,只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现,这种方法可以获得比较高的编辑效率。研究人员将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠,实现心脏特异性敲除。Myh6表达水平降低50%以上,同时成功得到发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。

肺部

  目前对于肺部的病毒感染,普遍采用AAV病毒载体,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,一种是使用AAV2/9病毒载体,通过鼻内或气管内递送(经呼吸道)将病毒通过肺呼吸道递送,参考剂量是1×1011VG病毒,体积50ul;另一种新方法是使用新普京888.3app新研发的AAV-LUNG病毒载体,尾静脉注射特异性感染肺部:
  

  新普京888.3appAAV-LUNG感染肺部结果

肌肉

  目前,对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用AAV病毒载体,因为AAV不仅能够高效特异地靶向肌肉组织,且能在肌肉组织中表达持久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应,并且很容易被清除,表达时间比较短暂,较少被应用于肌肉组织的靶向表达。尽管慢病毒感染表达范围广泛,对培养的肌肉细胞均能高效表达,但是对肌肉组织的感染表达非常有限。目前靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1,AAV6和AAV9。其中,AAV9的表达效率最高,并且更容易在肌肉中高表达。
  
  1、注射方式
  
  应用病毒载体感染肌肉组织进行研究,一般分为系统注射和肌肉内注射,系统注射表达较均匀,但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收,导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射,可以在注射点附近高效表达,但缺点是病毒扩散十分有限,因此往往需要多点注射,一般每个点在5-10ul。
  
  2、应用案例
  
  注射方式:静脉注射
  
  载体:AAV-CMV-miniDystrophin
  
  血清型:rAAV2/9
  
  观察时间:16周

脂肪组织

  脂肪组织由大量脂肪细胞组成,分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织,脂肪组织是机体冗余能量储存的重要器官,同时也是重要的分泌器官,在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤修复等中有重要的生理功能。
  
  研究中,如果我们使用病毒载体感染脂肪组织,一般采用定点注射的方式。使用AAV病毒载体感染脂肪组织一般选取rAAV2/8血清型,在脂肪组织的多点注射中,每个点注射量大约1x1010总滴度的病毒载体。

  AAV感染脂肪

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